Solutions to common issues in widefield microscopy: vignetting, mosaicing and depth of focus

In questa tesi abbiamo sviluppato soluzioni a questioni comuni in materia di microscopia a campo largo. Abbiamo affrontato il problema della non omogeneità dell'intensità delle immagini acquisite e due forti limitazioni: l'impossibilità di acquisire immagini ad alto dettaglio rappresentative o dell'intero campione o di oggetti 3D con spessore non trascurabile. Per prima cosa abbiamo studiato le caratteristiche del problema denominato vignettatura, relativo alla distribuzione non uniforme del segnale di luce all'interno di ogni singola immagine. In particolare abbiamo proposto metodi dove la funzione di vignettatura è stimata utilizzando un insieme di immagini acquisite direttamente dal campione. In seguito, abbiamo studiato come risolvere il problema legato alla limitata dimensione del campo di vista della telecamera, al fine di essere in grado di acquisire una singola immagine ad alto ingrandimento rappresentativa dell'intera area del campione osservato. A questo scopo abbiamo sviluppato tecniche di mosaicatura in grado di operare on-line con l'acquisizione delle immagini. Partendo da una serie di immagini acquisite manualmente, abbiamo validato un approccio di registrazione in grado di creare velocemente un mosaico allineando accuratamente le singole immagini acquisite. Infine, abbiamo studiato come estendere virtualmente il campo di vista della telecamera lungo la terza dimensione, con lo scopo di poter ottenere singole immagini completamente a fuoco di oggetti 3D. Abbiamo proposto un metodo generale che non richiede alcuna informazione a priori. Per confrontare i risultati dei diversi metodi, in letteratura sono tipicamente usate diverse metriche comuni. Tuttavia nessuna metrica è in grado di confrontare diversi metodi usando immagini reali. In primo luogo abbiamo validato una metrica in grado di classificare i diversi metodi in accordo all'indice di qualità universale, ma senza bisogno di alcuna verità di riferimento. Poi abbiamo dimostrato che il metodo che abbiamo sviluppato risulta essere il migliore tra tutti quelli testati per estendere la profondità di fuoco.