Effetto della combinazione di cellule CD4+CD25+, cellule staminali emopoietiche CD34+e ATG nella prevenzione della risposta alloreattiva delle cellule T in vitro ed in vivo

Il trapianto delle cellule staminali emopoietiche umane CD34+ in combinazione con le cellule T regolatorie CD4+/CD25+ FoxP3+ (Tregs) potrebbe prevenire l'alloreattività verso le cellule staminali emopoietiche e ridurre il rischio di rigetto in trapianti allogenici HLA non correlati. Per dimostrare questa ipotesi abbiamo messo in coltura le cellule CD34+ e le cellule CD4+/CD25+ isolate con metodica immunomagnetica (Miltnyi Biotec)da sangue periferico non manipolato,sangue periferico mobilizzato con G-CSF o da Cordone ombelicale. Gli esperimenti svolti in vitro, hanno evidenziato che le cellule Tregs arricchite, ottenute dalla stessa fonte delle cellule CD34+( autologhe), mostravano un effetto inibitorio maggiore sulle celulle T alloreattive, rispetto alle cellule Tregs ottenute da un donatore terzo(allogenico).Inoltre l'attività immunosoppressoria delle Tregs era mantenuta dopo stimolazione con cellule CD34+ allogeniche e i Tregs non modificavano l'attività clonogenica delle cellule staminali CD34+. Avendo ottenuto questi dati in vitro abbiamo trapiantato in topi NOD/SCID le cellule Tregs e le cellule CD34+ in rapporto 1:1 o 1:2 ed è stato osservato un normale attecchimento delle cellule staminali. Incubando queste cellule con dosi fisiologiche di timoglobulina derivata da coniglio (nota molecola immunosopressoria) non veniva modificato il numero dei Tregs dopo 6 giorni di coltura. Dopo l'esposizione alla Timoglobulina, inoltre, i Tregs mantenevano la loro attività soppressoria, aumentava l'espressione del recettore chemochinico CCR7, e venivano rilasciate diverse citochine principalmente l'interleuchina 10(IL-10). Tali dati dimostrano come sia le cellule tregs autologhe che quelle allogeniche potrebbero essere trapiantate insieme alle cellule staminali CD34+ dopo un regime preparatorio di terapia che include la timoglobulina. A tale scopo sono state eseguite selezioni di Tregs da aferesi di donatori sani mobilizzati con G-CSF su scala clinica utilizzando biglie immunomagnetiche Clinical grade (Miltenyi Biotec) e sono state confrontate 2 modalità di selezione con due o tre passaggi con o senza la deplezione dei monociti CD14+.Si è dimostrato così che è possibile selezionare un numero uguale di CD34+ e Tregs ,che con la metodica che prevede la deplezione dei monociti si ottiene una popolazione di cellule Tregs più pura ( > 80%) e infine le applicazioni possibili di questi risultati includo: trapianto di cellule CD34+ del donatore insieme a cellule Tregs in trapianti aploidentici ; infusione of cellule tregs isolate da PBSC mobilizzati con G-nei casi di pazienti con GVHD steroide-resistente; infusione di G-Tregs del donatore nei casi di rigetto di organo trapiantato da of donatore ancora vivente.